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《免疫学和免疫学检验》

第二节　凝胶内沉淀试验

最常用的凝胶为琼脂糖。由于凝胶内沉淀试验具有高度的敏感性和特异性，且设备简单、操作方便，因而得到广泛应用。

该试验利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。适宜浓度的凝胶可视为一种固相的液体，水分占98％以上，凝胶形成网络，将水分固相化。抗原和抗体蛋白质在此凝胶内扩散，犹如在液体中自由运动。大分子（分子量为20万以上）物质在凝胶中扩散较慢，可利用这点识别分子量的差别。另外，由于琼脂网孔有一定的限度，抗原抗体结合后，复合物的分子量至少应在百万以上，这种超大分子则被网络在琼脂中，经盐水浸泡也只能去除游离的抗原或抗体，这对后面的分析带来极大的方便。

凝胶内沉淀试验可根据抗原与抗体反应的方式和特性，分为单向扩散试验和双向扩散试验。

一、单向扩散试验

本试验是在琼脂胶中混入一定量抗体，使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。根据试验形成可分为试管法和平板法两种。

（一）试管法

该方法由Oudin于1946年报道。将血清或纯化抗体混入约50℃的0.7％琼脂糖溶液中，注入小口径试管内，待凝固后，在凝胶中面加入抗原溶液，让抗原自由扩散入凝胶内，在抗原与抗体比例恰当位置形成沉淀环。在黑色背景斜射光处，极易观察这种白色不透明沉淀带。

沉淀环的数目和形态受抗原和抗体性质的影响。溶液内含有多种抗原，在凝胶中含有各自的抗体，扩散后形成相应的抗原抗体复合物，出现多条区带。试管上部的沉淀带表示抗原量少或者抗体量多；反之，下面的沉淀带则是抗原量大，抗体量少。另外，抗体类型也有很大区别，如用兔抗血清（R型抗体），抗体过量亦可形成复合物，因而沉淀带宽而界线不清；如用马抗血清（H型抗体），抗原或抗体过量皆不形成复合物，因而只在比例合适处形成界线清晰的沉淀物（图12-1）。

图12-1两种抗血清形成的沉淀带示意图

（二）平板法

此法由Mancini于1965年提出，是目前最常用的简易抗原定量技术，其要点是：将抗体或抗血清混入0.9％琼脂糖内（约50℃），未凝固前倾注成平板，凝固后在琼脂板上打孔（一般直径约3～5mm），孔中加入抗原溶液，放室温或37℃让其向四周扩散，24～48h后可见周围出现沉淀环（图12-2）。

图12-2单向辐射状免疫扩散

上排为5个不同的参考中、下排为患者血清

下排右2为一异常病理血清

由于试验中抗原向四周扩散，故又称单向辐射状免疫扩散（singleradialimmunodeffusion，SRID）。最后，测量沉淀环的直径或计算环的面积。沉淀环直径或面积的大小与抗原量相关，但不是直线相关，而是对数关系。同时，这种沉淀还与分子量和抗散时间有关。抗原含量与环径的关系有两种计算方法：

1．Mancini曲线适用于大分子抗原和长时间扩散（＞48h）的结果处理。使用方格计算纸划线，扩散环直径的平方与抗原浓度呈线性关系（图12-3）。

利用公式表示：C/d2＝K

图12-3Mancini曲线

T1为1624h；T2为24～48h；T3为48h以上；可见T3为直线，T1为反抛物线

式中C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数。

2．Fahey曲线这种曲线适用于小分子抗原和较短时间（24h）扩散的结果处理。使用半对数划线，浓度的对数与扩散圈直径之间呈线性关系（图12-4）。

用公式表示：log/d＝K

式中C＝抗原浓度（mg/d），d＝沉淀环直径，K＝发常数。

各种蛋白质只要符合以下3条，几乎皆可用SRID定量测定：①备有仅对某待测抗原的单价特异抗血清；②备有已知含量的标准品；③待测品含量在1.25μg/ml以上（单向扩散技术的敏感度）。现在最常用于临床检测的项目有IgG、IgA、IgM、C3、C4、转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多种血浆蛋白。

在检测标本的同时，用已知含量的标准抗原作5～7个稀释度，同时测量圈的大小（见图12-2）。按扩散时间（Fahey和Mancini法）的不同，取方格纸或对数纸做标准曲线图。

单向琼脂免疫扩散法作为抗原的定量方法，其重复性和线性皆是可信赖的，唯敏感度稍差（不能测μg/ml以下含量）。另外，以下影响因素也应注意。

1．抗血清不但要求亲和力强、特异性好、效价高，而且还应注意存放的方法，防止效价下降。

2．标准曲线测定必须同时制作，决不可一次做成，长期应用。

3．测定时必须同时加测质控血清，以保证测量准确性。

4．有时出现扩散圈呈两重沉淀环的双环现象。这是由于出现了不同扩散率、但抗原性相同的两个组分。例如α重链病血清中出现的α重链和正常IgA发生反应，就形成内外两重环（图12－2）。

图12-4Fahey曲线

t1为1624h；t2为2448h；t3为48h以上可见t1为直线，t3为抛物线

5．在单向扩散试验时，有时会出现结果与真实含量不符，这主要出现在Ig测定中。如用单向克隆抗体或用骨髓抗原免疫动物获得的抗血清，都存在结合价单一的现象，若用此作为单向扩散试剂测量正常人的多态性抗原，则抗体相对过剩，使沉淀圈直径变小，测量值降低。

6．测得结果的假阳性升高现象与上面相反，如用多克隆抗体测定单克隆病（M蛋白），则抗原相对过剩（单一抗原决定簇成分），致使沉淀圈呈不相关的扩大，从而造成某一成分的伪性增加。

二、双向扩散试验

在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可作出对抗原或抗体的定性分析。双向扩散也可分为试管法和平板法两种方法。

（一）试管法

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